BD ProbeTec ™
Lo Strumento Lettore BD ProbeTec™ e' il modulo dove si svolge, in automatico, la fase di Amplificazione e Rilevamento.
E' corredato di computer incorporato con display LCD e di stampante laser.
STRUMENTAZIONE ACCESSORIA
La metodica, nel suo insieme, si avvale di una serie di componenti strumentali, associate alle fasi di preparazione e di priming, che precedono la fase di amplificazione e rilevamento.
In particolare :
- il Termoblocco di Priming
(componente comune)
- il Blocco di Lisi
(Clamidia / Gonococco)
- l'Ancillary Group formato da fornelletto, sonicatore e centrifuga
( Micobatteri )
- la Multipipetta elettrica programmabile
( componente comune )
STRUTTURA INTERNA E MECCANISMO
La lettura si avvale di un sofisticato meccanismo attico basato sull'azione di Leds, fibre ottiche e filtri.
La fluorescenza sviluppata nel corso della Amplificazione vien letta con una lettura al minuto, in modo da fornire una cinetica in tempo reale degli ampliconi prodotti.
Essa avviene sul fondo dei micropozzetti e tradotta in unita' MOTA ( Metric Other Than Accelleration ). Oltre un certo valore soglia il risultato viene interpretato come positivo.
Il supporto a micropiastra, contenente i micropozzetti di Amplificazione sigillati, viene inserito nell'apposito spazio all'interno dello strumento, per il suo trasporto all'interno del sistema di lettura termostatato. Nell'arco di 60 minuti il meccanismo ottico presente traduce in segnale MOTA il dato di fluorescenza emessa, per ogni singolo Test analitico e Test di controllo di Amplificazione relativo
GESTIONE DATI E REFERTAZIONE
Computer, Monitor LCD e Tastiera incorporati sono parte integrante dello Strumento di lettura, e consentono la gestione dei Dati in esame.
E' prevista l'accettazione dei dati del Set di lettura, con i riferimenti anagrafici, ed e' prevista l'accettazione con relativa memorizzazione di piu' Set di lettura successivi. Le varie sedute analitiche memorizzate sono quindi disponibili per la relativa selezione e attivazione del Test corrispondente.
Un programma di configurazione consente di personalizzare le impostazioni del sistema in termini di modalita' di accettazione, segnaletica, altri dati di base, e tipologia del tipo di Test in default nell'ambito del menu' dei Test disponibili.
La memoria dei Dati consente il costante mantenimento delle ultime 30 sedute.
La Refertazione si avvale di Stampante Laser e produce sia un referto con la lista degli esiti e sia un referto dello specchio della piastra analizzata con gli specifici dati numerici MOTA. E' sempre possibile la refertazione di Set di lettura precedenti gia' refertati e ancora in memoria
IL MECCANISMO DI AMPLIFICAZIONE E LETTURA
La Tecnologia Strand Displacement Amplification SDA
L'amplificazione del DNA nel Sistema automatico Probetec e' realizzata con la tecnologia Strand Displacement Amplification o SDA.
In questa tecnologia, associata ad amplificazione e rilevamento in tempo reale, non sussistono i cicli termici della amplificazione tradizionale, in quanto, dopo la fase di priming e la genesi del bersaglio, il medesimo diventa stampo per lo sviluppo esponenziale del DNA, attraverso un intervento coordinato di enzimi comprendente una specifica azione litica ed una successiva azione polimerasica.
La genesi del bersaglioanch'essa coordinata dall'azione di primer specifici di enzima di restrizione e di DNA polimerasi, porta allo sviluppo del target di amplificazione, rappresentato da un determinato frammento di DNA in cui ogni singola elica funge da stampo.
La fase SDA esponenziale o di Amplificazioneinizia con l'attacco del primer ad una regione specifica del target.
La DNA polimerasi ricompone la doppia elica del target.
Successivamente l'enzima di restrizione BsoBI, in un punto, taglia il filamento del DNA bersaglio modificato in modo che la DNA polimerasi da un lato sintetizzi un nuovo filamento e dall'altro sposti il filamento precedentemente sintetizzato.
Tutto questo consente di evitare i cicli termici, di ridurre i tempi di analisi attraverso una metodica di amplificazione che opera in isoterma.
Il metodo e' inoltre Real Time, Amplificazione e Rilevamento avvengono in tempo reale, con simultanea amplificazione e lettura dello sviluppo di fluorescenza.
Controllo interno di amplificazione e reazione in fase omogenea o liquida completano le caratteristiche di un metodo all'avanguardia e di ultima generazione.
Il rilevamento del DNA con sviluppoe lettura della Fluorescenza e' possibile per la presenza di sonde specifiche.
Nel caso del Test CT e GC la stessa e' formata da una sequenza di ibridazione o target specifico e da una struttura a forcina con collegati i due fluorocromi Fluoresceina e Rodammina e con una sequenza sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione BsoBI.
Quando la forcina e' intatta, l'eccitazione della Fluoresceina a 485 nm provoca emissione di fluorescenza a 525 nm.
Tuttavia la Rodammina emette a 610 nm cosicche lo strumento non puo' registrare la fluorescenza della Fluoresceina.
Quando la SDA e' attiva e la struttura a forcina si attacca al bersaglio, le susseguenti attivita' polimerasiche portano alla distensione della forcina fino a renderla attaccabile dall'enzima di restrizione.
L'attacco di tale enzima comporta la separazione dei due fluorocromi e la possibilita' di rilevare la fluorescenza della Fluoresceina.
Ogni minuto si verifica una lettura atta a fornire una cinetica in tempo reale degli ampliconi prodotto dalla SDA.
Nel caso dei Test relativi ai Micobatteri le sonde sono due.
Una sonda serve al rilevamento del campione, e l'altra al monitoraggio del controllo interno di amplificazione. Entrambe sono formate da una sequenza di ibridazione e da una forcina con collegati un fluorocromo (Fluoresceina o Radammina ) e il rispettivo soppressore di fluorescenza. Per il resto il meccanismo e' analogo a quello descritto per il Test CT. L'intervento dell'enzima di restrizione separa il fluorocromo dal soppressore specifico cosi' da consentire la lettura della fluorescenza.
Chlamydia tracomatis CT
Chlamydia tracomatis + Neisseria gonorrhoeae CTGC
Campioni da tampone di prelievo endocervicale e uretrale maschile
Sono disponibili i Test e i Kit separati per la determinazione di Chlamydia t e per la determinazione simultanea di Chlamydia t e Gonococco.
Entrambi i Kit di base comprendono i micropozzetti in numero di 4 micropiastre da 96 per 384 determinazioni, includendo i 2 controllo per seduta positivo
e negativo.
Il Kit contiene micropiastre di Priming, di Amplificazione, e di Controllo sia per la fase di Priming che la fase di Amplificazione, in numero di 4 da 96 micropozzetti separabili (micropiastre 8 x 12). Contiene inoltre gli adesivi anticontaminazione, i coperchi copripiastra e le buste da scarto, quali accessori di completamento della procedura. I micropozzetti contengono tutti i reattivi in forma anidra.
I Controlli sono disponibili in confezione da 20 (20 tubi di C pos e 20 di C neg), in forma da ricostituire con il diluente
Campioni di Prelievo con tampone endocervicale e uretrale
I Tubi per il Test sul materiale da tampone, in confezione da 400 per 400 Campioni o Test, contengono 2 ml di tampone diluente di lisi, e servono ad accogliere il Campione proveniente dai tamponi di prelievo
I Tamponi per prelievo endocervicale, I Tamponi per prelievo uretrale maschile sono disponibili in confezioni da 100 per 100 prelievi
Campioni urinari
I Tubi per il Test sui Campioni Urine, non contengono diluente sono ugualmente in confezione da 400
Il Diluente, da aggiungere ai tubi e' presente in Flaconi da 225 ml
L' UPP o conservante urine serve a trattare e conservare le Urine ed e' in confezione da 100 bustine per 100 trattamenti
Accessori comuni
I Puntali con filtro, per la multipipetta, sono in confezione da 720, valida per 200 Test
Adesivi, Copripiastra, Buste da scarto e Tappi dei tubi sono disponibili anche in forma di codici separati e dunque addizionali, in caso di necessita'
La conservazione dei Reagenti si svolge a Temperatura Ambiente
Mycobacterium tuberculosis Complex
Test diretto DTB
Mycobacterium tuberculosis Complex
Test di identificazione da coltura CTB
Mycobacterium avium Complex
Test di identificazione da coltura MAC
Mycobacterium kansasii
Test di identificazione da coltura KAN
Campioni di origine respiratoria ( espettorato ) pretrattati con la metodica di fluidificazione - decontaminazione classica ( NALC-NAOH )
Sono disponibili i Kit per il Test di diretta ricerca di Mycobacterium t Complex e i Kit per la identifificazione da coltura di Myc t Complex, Myc avium Complex
e Myc kansasii
Il Kit per il Test diretto DTB comprende 3 micropiastre di Priming e 3 micropiastre di Amplificazione da 32 micropozzetti separabili ( 8 x 4 ), valide per 96 Test, 2 Controlli per seduta inclusi, nonche' accessori come adesivi anticontaminazione, copripiastra e buste da scarto.
I Kit per i Test di conferma comprendono 3 micropiastre da 8 micropozzetti separabili, valide per 16 Test.
In tutti i casi il Test di Controllo della Amplificazione e' interno, incorporato nel micropozzetto del Test
I Controlli sono disponibili in confezione da 20 (20 tubi di C pos e 20 di C neg)
I Tubi per il Test, vuoti, in confezione da 200 per 200 Test, servono ad accogliere il Campione decontaminato
Il Kit di preparazione, disponibile nelle versioni per il Test diretto e per i Test di conferma, contiene i flaconi con i 3 tamponi : di lavaggio ( 225 ml ), di lisi ( 50 ml ) e di neutralizzazione ( 150 ml )
I Puntali con filtro, per la multipipetta, sono in confezione da 720, valida per 360 Test
Adesivi, Copripiastra, Buste da scarto e Tappi dei tubi sono disponibili anche in forma di codici separati e dunque addizionali, in caso di necessita'
I reagenti si conservano a Temperatura Ambiente
IL METODO
Chlamydia tracomatis CT
Chlamydia tracomatis + Neisseria gonorrhoeae CTGC
Fase preliminare di preparazione con i Campioni da Tampone
Dopo il prelievo i Tamponi endocervicali o uretrali contenenti il campione possono essere consevati da 1 a 6 giorni a 2-30 °C
I Tamponi sono inseriti nei Tubi contenenti il tampone di lisi, quindi agitati contro le pareti e vortexati. In questo stato il Campione e' conservabile 6 ore a T.A. e fino a 3 giorni in frigo.
Il trattamento dei Tubi contenenti i Controlli comprende la loro preliminare ricostituzione col tampone medesimo
Fase preliminare di preparazione con i Campioni di Urina
Dopo il prelievo il contenitore con il Campione viene trattato con l'UPP per essere conservato a Temperatura Ambiente da 1 a 6 giorni ( CT ) e da 1 a 3 giorni ( CTGC ).
Le Urine cosi' trattate vengono aggiunte nella quantita' di 4 ml al tubo di esame, quindi centrifugate, decantate e risospese in 2 ml di tampone di lisi.
In questo stato il Campione e' conservabile 6 ore a T.A. e fino a 3 giorni in frigo.
Il trattamento dei Tubi contenenti i Controlli comprende la loro preliminare ricostituzione col tampone medesimo
Fase di lisi o di estrazione
Avviene con i tubi inseriti all'interno dell'apposito rack o blocco di lisi.
La fase ha la durata di 30 minuti a 110-114 °C, dopodiche' gli stessi tubi vengono fatti riposare per 15 minuti a Temperatura Ambiente
Fase di Priming e di Amplificazione
Per ogni Campione, sia nel Priming e sia nell'Amplificazione, si allestiscono, in parallelo e per colonne adiacenti a quelle del Test, i micropozzetti del Controllo Amplificazione, operando per ognuno di questi pozzetti, come per i pozzetti del Test.
I Campioni e i 2 Controlli pos e neg, con l'uso dell'apposita multipipetta programmabile, vengono trasferiti ai micropozzetti di Priming gia' predisposti in colonne nell'apposito supporto ( da 8 righe x 12 colonne ).
Questi contengono i primers e la sonda rilevatrice.
Il supporto con i micropozzetti di Priming, dopo una fase di 20 minuti a Temperatura Ambiente ( possibile fino a 6 ore ), viene inserito nell'alloggiamento interno dello specifico termoblocco per 10 minuti a 72 °C.
Si allestisce analogo supporto anche per i micropozzetti di Amplificazione che contengono i nucleotidi e gli enzimi, lo si inserisce nell'alloggiamento esterno dello stesso termoblocco a 54 °C.
Alla scadenza dei 10 minuti si opera, sempre con la multipipetta, il trasferimento dai micropozzetti di Priming ai micropozzetti di Amplificazione, si sigillano questi ultimi con l'adesivo e si inserisce il relativo supporto a micropiastra nel lettore incubatore Probetec.
Nello strumento ProbeTec di lettura si svolge il processo finale di Amplificazione e lettura simultanea, con la risposta del Test dopo 60 minuti
Mycobacterium tuberculosis Complex
Test diretto DTB
Mycobacterium tuberculosis Complex
Test di identificazione da coltura CTB
Mycobacterium avium Complex
Test di identificazione da coltura MAC
Mycobacterium kansasii
Test di identificazione da coltura KAN
Fase preliminare di preparazione ( Test DTB )
Il Campione, nel caso del Test diretto, e' stato pretrattato con NALC - NAOH come nel caso della preparazione dei Campioni per la coltura.
Tale Campione e' conservabile, come sedimento, prima del Test Probetec, 5 giorni in frigo oppure 3 mesi in congelatore ( - 20 °C ).
0,5 ml di tale Campione viene aggiunto al Tubo del Test, che viene a sua volta addizionato di 1 ml del tampone di lavaggio ( tampone 1 ).
Dopo una vortexata di 5 secondi i tubi, opportunamente chiusi, contenenti i Campioni, sono pronti per la centrifugazione di 3 minuti a 12.200 rcf ( la minicentrifuga fa parte degli accessori strumentali della metodica )
Fase di uccisione termica dei Micobatteri o del fornelletto
Con il fornelletto, fornito insieme agli altri accessori strumentali della metodica, i Campioni vengono sottoposti ad una sessione termica che ha la durata di 30 minuti a 105 °C. In questo modo si ha l'uccisione dei Micobatteri.
Dopo la breve centrifugazione successiva di 10 secondi, vengono addizionati di 0,1 ml di tampone lisante ( tampone 2 )
Fase della lisi-estrazione o della Sonicazione
45 minuti di sonicazione ( nello specifico sonicatore fornito con gli accessori strumentali della metodica ) a 65 °C, consentono l'estrazione del target.
I Campioni vengono dunque centrifugati ( 10 secondi ), addizionati con 0,6 ml di tampone neutralizzante ( tampone 3 ), e ulteriormente centrifugati e vortexati per renderli pronti alla fase finale di priming e Amplificazione.
A questo punto si possono conservare 12 ore a T.A., 4 giorni in frigo e 3 mesi in congelatore
Fase di Priming e di Amplificazione
I Controlli vengono preparati ricostituendo i tubi relativi con 0,1 ml di tampone 2 e 0,6 ml di tampone 3. Dopo il vortex e la centrifuga ( 10 sec ) sono cosi' pronti per passare, insieme ai Campioni, alla fase Probetec vera e propria.
Con i Test dei Micobatteri il Controllo di Amplificazionee' interno ai micropozzetti del Test e non e' pertanto previsto l'allestimento in parallello di pozzetti di Controllo di Amplificazione.
I Campioni e i 2 Controlli, con l'uso dell'apposita multipipetta programmabile, vengono trasferiti ai micropozzetti di Priming gia' predisposti in colonne nell'apposito supporto ( da 8 righe x 12 colonne ). Questi contengono i primers e la sonda rilevatrice. Il supporto con i micropozzetti di Priming, dopo una fase di 20 minuti a Temperatura Ambiente ( possibile fino a 6 ore ), viene inserito nell'alloggiamento interno dello specifico termoblocco per 10 minuti a 72 °C.
Si allestisce analogo supporto anche per i micropozzetti di Amplificazione che contengono i nucleotidi e gli enzimi, lo si inserisce nell'alloggiamento esterno dello stesso termoblocco a 54 °C.
Alla scadenza dei 10 minuti si opera, sempre con la multipipetta, il trasferimento dai micropozzetti di Priming ai micropozzetti di Amplificazione, si sigillano questi ultimi con l'adesivo e si inserisce il relativo supporto a micropiastra nel lettore incubatore Probetec.
Nello strumento ProbeTec di lettura si svolge il processo finale di Amplificazione e lettura simultanea, con la risposta del Test dopo 60 minuti
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