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LO STRUMENTO : STRUTTURA

Lo Strumento BD BACTEC™ MGIT™ 960 e'  incubatore e lettore in continuo delle provette MGIT di coltura e Antibiogramma dei Micobatteri.
Comprende 3 Cassetti ciascuno composto di 320 posizioni disponibili.
Le medesime posizioni sono disposte verticalmente a costituire, per ogni cassetto, una disposizione di 16 righe per 20 colonne.
Per ogni cassetto una colonna specifica a sinistra contiene la serie delle provette di calibrazione.
Il sistema di lettura e' ottico ed e' situato sotto la struttura delle posizioni.
Esso comprende 16 sistemi di rilevazione ( uno per ogni riga ) che leggono da sinistra a destra e dall'esterno verso l'interno.
Il lato esterno di ogni cassetto presenta un sistema di rilevazione luminoso con 3 segnalatori di Status : positivo, negativo, errore ( ad indicare la presenza di uno o piu' di questo status all'interno del relativo cassetto ).
Altrettanti segnalatori luminosi di Status sono presenti all'interno e in corrispondenza di ciascuna posizione ( Leds verdi e Leds rossi ) a segnalare la situazione di ogni posizione e a guidare nelle operazioni di lavoro l'operatore.
L'accettazione dei Flaconi MGIT avviene attraverso la lettura del codice a barre effettuata da un lettore incorporato nello strumento e disposto sul lato anteriore, a destra del display.
Tutte le operazioni di lavoro sono effettuate attraverso l'utilizzo di un Display LCD ad icone e pulsanti di facile utilizzo e di immediata comprensione, disposto anteriormente nella parte alta dello strumento.
Il computer incorporato esegue il controllo del Sistema e delle letture, nonche' la memorizzazione dei Dati.
E' interfacciabile con il Sistema  gestionale Epicenter per la gestione delle anagrafiche, e per una piu' ampia gestione dei Dati, dell'archivio e delle statistiche.
La struttura del BD BACTEC™ MGIT™ 960, e la grandezza delle posizioni e dei Flaconi MGIT rendono il Sistema estremamente versatile ed adattabile alle piu' grandi routine, senza problemi di spazio. E' infatti in grado di leggere in contemporanea, con un solo modulo, e come nessun altro sistema, fino a 960 Flaconi, e di gestire dunque una routine di 8.000 campioni annui
 
LA TECNOLOGIA DI LETTURA

La lettura dei Flaconi MGIT e' legata ad un sofisticato sistema ottico, che sfrutta la rilevazione del segnale di Fluorescenza emesso dai Flaconi positivi.
Il Detector ( uno per ogni riga ) situato sotto la struttura delle posizioni,. legge, muovendo da sinistra a destra e dall'esterno verso l'interno, la Fluorescenza che, il sensore situato al fondo del Flacone, emette se stimolato dall riduzione di Ossigeno.
Detto sensore, incorporato e protetto in una matrice solida, risulta sensibile ed inibito dall'Ossigeno presente nel mezzo. Una volta che il metabolismo dei Micobatteri riduca la tensione di Ossigeno, lo stesso sensore, liberato dall'effetto inibente, emette Fluorescenza.
Tale tecnologia, esclusiva, rende il Sistema, estremamente sensibile e piu' sensibile delle tecnologie che sfruttano la produzione di CO2 ( i Micobatteri sono basso produttori di CO2 ).
Il Sistema effettua la lettura del Flacone ad intervalli di 1 ora, e costruisce la curva di interpretazione estrapolando ogni punto della curva attraverso il valore medio di 5 letture successive
 
LA PROCEDURA STRUMENTALE

Le operazioni di lavoro legate all'uso dello Strumento risultano semplici e facilitate da un Sistema che funge da guida e da controllo.
Il Display LCD ad icone e pulsanti fornisce tutte le segnalazioni che guidano l'utilizzatore in tutte le varie operazioni.
A riposo dà le indicazioni relative allo Status dei Flaconi presenti, delle posizioni e dei cassetti.
All'atto delle operazioni e dunque della apertura del cassetto fornisce in modo semplice ed immediato il segnale della funzione da eseguire.
Un simbolo specifico compare a Display e in corrispondenza del pulsante funzione da attivare, per guidare l'utente nelle relative attivita' :
1. Inserimento nuovi Flaconi
2. Scarico dei Flaconi negativi
3. Scarico dei Flaconi positivi
4. Scarico dei Flaconi in lettura
5. Identificazione Flaconi anonimi ( inseriti senza processazione del Bacode )
6.Risoluzione degli Errori
L'inserimento di un nuovo Flacone presuppone la lettura del suo codice a barre e l'introduzione dello stesso nella posizione segnalata dal Sistema.
Lo scarico dei Flaconi negativi o positivi, segnalati con segnalazione simbolica e ottica, avviene a sua volta con la lettura del suo codice a barre.
E' possibile estrarre i Flaconi quando ancora non risultano negativi e sono in corso di lettura.
Eventuali errori dell'utilizzatore come scambio di posizione, errato inserimento ecc.
Sono di facilissima gestione e risoluzione.
Attraverso la Configurazione del Sistema e' possibile configurare vari parametri e, in particolare, il numero di giorni di protocollo ( il default e' di 42 giorni )
 
REAGENTI : I PRODOTTI PER LA COLTURA

I FLACONI MGIT 7 ml

La coltura a lettura in automatico, affidata al BACTEC MGIT 960, si svolge nei Flaconi MGIT 7ml.
I Flaconi MGIT 7 ml, con tappo a vite e in materiale plastico ( 16 x 100 mm ), in linea con le norme di sicurezza, presentano il fondo a U e contengono, al fondo stesso del Flacone, incorporato in una matrice solida, il sensore di Fluorescenza.
Il composto fluorescente e' incapsulato e protetto nel silicone. Esso e' sensibile e inibito dall'Ossigeno presente nel mezzo di coltura, e in tal caso emette solo una debole fluorescenza di base. Quando il metabolismo dei microorganismi presenti riduce la tensione di Ossigeno il grado di fluorescenza emessa aumenta fino al valore rilevabile come segnale di positivita'.
Il terreno liquido di crescita e' il Middlebrook 7H9 modificato.

La formula dettagliata del contenuto del Flacone MGIT e' la seguente :
-Brodo Middlebrook 7H9 modificato 5.9  g  / Litro di acqua purificata
-Peptone di caseina 1,25 g
-Glicerolo 3,1 ml
il tutto per 7 ml di brodo di coltura
-110 ul di indicatore Tris 4, 7-difenil-1, 10-fenantrolina cloruro di rutenio pentaidrato
contenuto in una base di gomma di silicone
Le provette contengono inoltre CO2 al 10% e sono chiuse con tappo a vite di polipropilene.
Sono presenti in confezioni da 100 unita'
La loro conservazione avviene a 2-25 °C

IL SUPPLEMENTO PANTA-OADC

I Flaconi MGIT 7 ml, prima di essere inoculati con il Campione, devono essere supplementari con la miscela PANTA-OADC ( confezione a parte rispetto a quella dei Flaconi MGIT 7 ml ).
Detta miscela ne consente l'arricchimento ( con l'OADC ) e l'aggiunta del mix di antibiotici( PANTA ) a rendere il brodo di crescita maggiormente selettivo
verso i Micobatteri.
I due componenti sono presenti nella confezione in modo separato. Il liquido OADC e' pronto all'uso e viene utilizzato per la ricostituzione del PANTA liofilo.
La confezione comprende 6 Flaconi OADC e 6 Flaconi PANTA
 
La formula dettagliata del contenuto del Flacone OADC e PANTA e' la seguente :

OADC ( liquido )
-Albumina bovina 50 g / Litro di acqua purificata
-Destrosio 20 g
-Acido oleico 0,1 g
-Catalasi 0,03 g
-POES 1,1 g ( sostanza che favorisce l'assorbimento dei fattori di arricchimento )
 il tutto per 15 ml

PANTA ( liofilo )
-Polimixina B 6.000 Unita'
-Anfotericina B 600 ug
-Acido Nalidixico 2.400 ug
-Trimethoprim 600 ug
-Azlocillina 600 ug

Tutto il contenuto del Flacone OADC ( 15 ml ) serve a ricostituire una Fiala di PANTA.
L'OADC si conserva al buio e a 2-8 °C. Il PANTA ricostituito si conserva a 2-8 °C fino a 24 ore

IL METODO

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

La metodica MGIT presuppone la preparazione del campione con il metodo classico al NALC-NAOH. In proposito la Becton Dickinson ( vedi " Un corredo completo di reagenti e accessori " ) fornisce tutti gli accessori e il materiale pronto che serve alla fase preliminare ( prelievo e preparazione del campione ).
Qualunque campione clinico polmonare, extra-polmonare e urine ( con l'eccezione del sangue ) e' utilizzabile con il metodo MGIT.
Il Kit MYCOPREP comprende i reagenti pronti all'uso per l'applicazione della metodica classica di digestione-decontaminazione al materiale clinico che lo richiede ( es. sputum ).
Occorre naturalmente considerare che il trattamento preliminare non e' lo stesso per tutti i vari tipi di campioni e che il metodo classico di digestione-decontaminazione si applica generalmente ai campioni clinici per la ricerca dei Micobatteri, con le dovute eccezioni per certe situazioni particolari e con certi altri tipi di accorgimenti da considerare nella preparazione di certi campioni speciali ( vedi raccomandazioni del CDC relative al trattamento dei vari tipi di campioni )

La metodica classica di preparazione, contenuta nel Mycoprep, comprende i passaggi seguenti :
1. Preparazione della soluzione NAOH 2% - N Acetil L Cisteina
Schiacciando l'ampolla di NALC contenuta all'interno del Flacone di NAOH al 2% si ottiene la relativa soluzione pronta all'uso. La medesima, nella quantita' di 75 ml
( o di 150 ml nel caso della confezione Mycoprep piu' grande ), e' stabile 24 ore
2. Digestione - Decontaminazione
Il medesimo viene aggiunto in pari quantita' ( 10 ml ) alla soluzione NAOH-NALC in una provetta 50 ml da centrifuga con tappo a vite. Successivamente la provetta viene vortexata e lasciata a riposo 15 minuti a Temperatita Ambiente
3. Neutralizzazione
La si effettua aggiungendo tampone fosfato ( PH 6.8 ) nella dose che porta la soluzione a 50 ml.
Quindi si centrifuga 15-20 minuti a 2200-2500 x g.
Il tampone fosfato viene preparato aggiungendo il contenuto della busta predosata ad acqua distillata e sterilizzando in autoclave a 121 °C per 15 minuti
4. Preparazione del campione di semina
Dopo decantazione il sedimento viene risospeso in 2 ml circa di tampone fosfato ad ottenere il materiale di inoculo, valido sia per l'allestimento dei vetrini che per la coltura ( inoculo della provetta MGIT 7 ml )

PREPARAZIONE DELLA PROVETTA DI COLTURA MGIT 7 ml

Il Flacone MGIT 7 ml deve, prima dell'inoculo del campione digerito e decontaminato, deve essere supplementato con la miscela OADC-PANTA.
Una volta supplementato con detta miscela nella quantita' di 0,8 ml puo' essere inoculato con 0,5 ml del campione, tenendo presente di utilizzare 0,1 ml dello stesso campione per l'inoculo contemporaneo di terreni in agar

LETTURA E RISULTATI

La provetta MGIT 7 ml supplementata ed inoculata viene inserita nello strumento Bactec 960 con la procedura strumentale di accettazione dei Flaconi, che prevede l'uso del menu  interfaccia strumento e la lettura del codice a barre della provetta.
Il Flacone accettato ed inserito e' incubato a 37 °C e viene letto, per tutto il tempo di protocollo impostato ( default di 42 giorni ), attraverso il sistema di lettura della fluorescenza, per letture distanziate di un 'ora.
La costruzione della curva, che avviene per punti ottenuti da ogni 5 letture, consente la interpretazione strumentale dello stato del Flacone.

I REAGENTI PER L’ANTIBIOGRAMMA

I Reagenti dell'Antibiogramma Bactec MGIT 960 comprendono gli antibiotici in forma liofila del pacchetto S.I.R.E. e della PZA, nonche' il rimanente dei reattivi necessari alla messa a punto del Test, quali il supplemento OADC specifico ( privo di POES ) e i tubi MGIT, standard nell' Antibiogramma S.I.R.E. e specifici a PH 5.9, nel caso dell'Antibiogramma Pirazinamide PZA
Antibiogramma S.I.R.E. a concentrazione critica per 40 Test
con Streptomicina STR, Isoniazide INH, Rifampicina RIF, Etambutolo EMB.
Comprende i 4 flaconi dei  4 Antibiotici in forma liofila ( da ricostituire con distillata sterile ) e il relativo supplemento liquido OADC ( privo di POES ) di arricchimento dei Tubi MGIT, strutturato in 8 Flaconi
Antibiogramma a concentrazione alta per 20 Test
Suddiviso in Kit separati per Streptomicina, Isoniazide, Etambutolo
comprendenti ciascuno il relativo antibiotico liofilo ( 1 Flacone ) e supplemento OADC ( 1 Fl )

Antibiogramma Pirazinamide PZA per 50 Test
con la Pirazinamide PZA liofila in 2 Flaconi e il relativo supplemento in 6 Flaconi.
Il Test con PZA prevede inoltre l'impiego del tubo MGIT specifico a PH 5.9 disponibile in confezioni da 25 Flaconi

Il supplemento liquido OADC dei Kit di Antibiogramma si differenzia
dal supplemento OADC della coltura per il fatto di non avere nella formula il POES (che serve solo nel caso della coltura )

Accessori a supporto contenuti nello Starter Kit consentono l'esecuzione fisica del Test.
Gli appositi Rack, disponibili in varie misure,  parte integrante dei componenti necessari , servono a raccogliere i tubi MGIT dell'Antibiogramma in modo tale da costituire le strutture complete del tipo di Test da inserire nello strumento ( es. da 5 posti per il Test completo SIRE, da 2 posti per il Test PZA, da 3 posti per la valutazione di un Antibiotico in concentrazione critica e alta ecc. )

IL METODO NELL’ANTIBIOGRAMMA

La metodica dei Test AST MGIT 960 prevede l'allestimento degli opportuni Set di indagine caratterizzati dai Rack raccoglitori e dai relativi tubi MGIT aggiunti del Campione positivo, dell'Antibiotico e del Supplemento.
Ogni Set si configura con, nella prima posizione a sinistra, il tubo MGIT di Controllo inoculato del Campione diluito 1:100, del Supplemento e privo di ogni Antibiotico.
Il Metodo AST MGIT 960 rappresenta infatti un metodo proporzionale

L'Antibiogramma Streptomicina, Isoniazide, Rifampicina, Etambutolo

Gli Antibiotici liofili del KIT S.I.R.E. Critical Concentration vengono ricostituiti con 4 ml di distillata sterile.
Gli Antiobiotici S.I.E. High Concentration vengono ricostituiti con 2 ml.
Una volta ricostituiti devono essere usati subito oppure congelati a -20 °C
fino a 6 mesi
Ogni tipo di Antibiotico del Set, o ogni concentrazione nei saggi di Antibiotici alle 2 concentrazioni viene aggiunto al relativo tubo MGIT nella quantita' di 0.1 ml, a ottenere opportune concentrazioni.

Il Supplemento OADC viene addizionato nella dose di 0.8 ml

Il Campione, che proviene da un colturale MGIT positivo di 1-2 giorni ( si diluisce 1:5 in FIS se positivo di 3-5 giorni o si passa su un nuovo tubo MGIT se positivo di oltre 5 giorni ), viene aggiunto per 0.5 ml

Il Controllo viene allestito a partire da un tubo MGIT, addizionato di Supplemento come nel caso degli altri tubi, con la differenza che si aggiungono 0.5 ml del Campione positivo prediluito 1:100 in FIS ( 0.1 ml + 10 ml FIS )

In questo modo si ottiene il Set completo della provetta di Controllo piu' i vari tubi ordinati secondo il programma del tipo di Set ( nel caso del Test S.I.R.E. Critical ad es.si hanno 5 tubi, il primo da sinistra che e' il Controllo e quindi nell'ordine i 4 tubi con STR, INH, RIF e EMB

L'Antibiogramma PZA Pirazinamide

Nel caso della Pirazinamide viene allestito un Rack a due posizioni, una per il Controllo e una per il tubo con la Pirazinamide.
Valgono le stesse considerazioni della metodica del Test S.I.R.E. con la differenza che i tubi MGIT non sono quelli standard ma quelli a PH 5.9

Procedura strumentale

Come avviene per il Test colturale si procede ad accettare a Strumento il Rack AST allestito tramite la lettura del codice a barre, che, in questo caso, e' di Rack.
In questo modo il Sistema riconosce il tipo Set di Antibiogramma ( la tipologia dei vari Set e' configurabile nel Software ).
Anche qui tutta la procedura e' guidata dal Software, dalle segnalazioni visive e dalle icone di controllo dell'interfaccia a display. Il Sistema informa dello Status delle letture e dell'esito di Test completato. Una volta che il Test e'completato il Rack relativo puo' essere rimosso e puo' essere controllato l'esito dell'Antibiogramma.
Tutta la procedura gode del massimo grado di automazione

Risultati

I Risultati dell'Antibiogramma, pronti nell'arco di un tempo notevolmente inferiore a quello dei metodi tradizionali ( mediamente 7-8 giorni ), possono essere visualizzati a referto.
Il Report riferisce il dato di posizione, di molecola, di concentrazione, di GU o valore di crescita e di Status di interpretazione S o R.
Tutto il Test si svolge sotto la stretta attenzione del Sistema che verifica la validita' dei valori e dei parametri, valutando ogni possibile errore e anomalia.
Nel caso del Test Pirazinamide il risultato si completa nell'arco di un tempo che varia fra i 4 e i 21 giorni

Gli Antibiotici di seconda scelta

L'Antibiogramma esteso agli Antibiotici di seconda scelta come Capreomicina, Etionamide, Kanamicina, Ofloxacina, PAS, Rifabutina, ed altri, puo' essere effettuato con il Metodo Radiometrico Bactec 460 TB, che rappresenta, allo stato attuale, l'unico metodo automatico riconosciuto per questo tipo di indagine

IL SISTEMA GESTIONALE : IL SOFTWARE BD BACTEC™ 960

Il Software associato e integrato al Sistema BD BACTEC™ 960, per la gestione dello Strumento, delle letture e dei relativi dati, e' un programma di semplice esecuzione e con tutte le Funzioni fondamentali per la gestione dei dati di lettura, dei risultati e delle refertazioni.
Consente la visualizzazione dello status dello Strumento e di tutte le posizioni con l'apporto di controlli continui visivi fatti del display e di segnalatori luminosi. Comprende la gestione dei dati e contempla varie funzioni di manutenzione
del Sistema, configurazione e Report.
I Flaconi sono visualizzati e memorizzati per Codice a barre, e, continuamente, se ne ha il controllo della condizione.
Flaconi di coltura e Set di Antibiogramma corrispondono ad altrettante
indicazioni a display con annesse le relative funzioni per la gestione
del carico dei Test in avvio e dello scarico dei Test conclusi

Tutte le Funzioni Software sono attivate mediante l'uso di tasti
di funzione- icona associate alla console - Display LCD incorporati.
Display in stand by : con la indicazione panoramica della Situazione generale
Accettazione : dei Flaconi di coltura e del Set di Antibiogramma
Scarico dei Test finiti : POS, NEG, ANTIBIOGRAMMA
Scarico dei Test in corso : sussiste la possibilita' di scarico precoce

Esistono altrettante Funzioni di gestione per il controllo delle situazioni atipiche  e di errore.
Identificazione Anonimi : dei Flaconi inseriti senza processazione
Risoluzione degli Errori : dei vari errori possibili

Configurazione del Sistema : dà la possibilita' di settare varie opzioni come i giorni di protocollo, la tipologia dei Set di Antibiogramma e molti altri parametri

Refertazioni : varie e nella forma di Lista come la Lista dei Positivi,
dei Negativi, degli esiti di Antibiogramma, dell'inventario

IL SISTEMA GESTIONALE : IL SOFTWARE BD EPICENTER™

Il Software BD BACTEC™ EpiCenter™ , indipendente da tutte le funzionalita' del MGIT
e del programma BD BACTEC™ MGIT™ 960, si integra facoltativamente al Sistema,
per associare all'analisi dei Micobatteri tutte le potenzialita' e le funzioni che
lo caratterizzano :

• Sistema operativo Windows NT
• Ampia e approfondita scheda paziente
• Integrazione con altri test ed esami microbiologici
• Grado elevato di personalizzazione
• Referto per singolo paziente
• Funzione filtri ed elaborazione ricerche statistiche ed epidemiologiche
• Funzione di creazione filtri e ricerche
• Report delle ricerche, in forma tabulare e grafica
• Collegamento in contemporanea agli altri strumenti BD
  di microbiologia
• Collegamento Host Computer