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研究用試劑 (Research Reagents and Antibodies)

    各種研究用試劑 Research Reagents

細胞凋亡是近年來醫學研究及細胞生物學的一個熱門主題。細胞凋亡是有機體一種正常調節的機制，多數真核細胞在不被機體需要、或受到嚴重損傷、或環境因子刺激時，皆可能進行細胞凋亡。它是一種主動性生理過程，在一定的生理或病理條件下，細胞會按照自身設定的程序進行自殺，直到細胞被吞噬，其目的在保持機體或組織的恆定。

活細胞或胞膜完整的細胞可將一些染料排斥在外，如 Propidium Iodide，7-AAD (7-Amino Actinomycin D )。由於早、中期凋亡細胞仍保留完整胞膜，故對上述染料拒染，可利用此法分辨凋亡細胞與壞死細胞。此法可與Annexin V 染色法、或免疫抗體染色法並用，簡單易行。

凋亡細胞的早期變化之一，是胞膜上磷脂絲氨酸（Phosphatidyl Serine）的外露。健康的細胞膜有一不對稱性，即磷脂絲氨酸只存在胞膜內層而不外露，此不對稱性之維持，需借助一套酶系與能量ATP；而凋亡細胞的早期變化是停止產能作用，故而無法維持此不對稱性，而使得磷脂絲氨酸外露。流式細胞技術可以Annexin V-FITC標記失去對稱性的細胞，或壞死細胞，再配合PI染色區別失去能量的凋亡細胞(PI-)，還是壞死細胞(PI+)，如圖。此法是檢測早期凋亡細胞的快速方法。

BD CBA多重訊號分析技術原理簡介

以先進生物科技使相同大小(7.5mm)的微球上帶有不同亮度的紅色螢光強度(PerCP，FL3)分別標示不同細胞激素抗體作為capture beads，亮度由高而低依次為IL-2、IL-4、IL-5、IFN-g、及TNF-a等抗體，將血清、血漿或是細胞培養液中的抗原抓下並結合於微球表面(見圖二(1))。再以橘紅色螢光染劑(PE，FL2)或是綠色螢光染劑(FITC，FL1)標示偵測抗體，是為detector reagents，來偵測與微球結合的抗原並顯色(見圖二(2)、(3))。配合上CBA分析軟體與Microsoft Excel(Mac版本)自動作標準曲線圖以定量各分析物(見圖二(4))。

從染色至分析於4-5小時內即可完成，檢測細胞濃度的範圍為0 – 5000pg/ml。檢品量僅50ml，即可同時獲得6種細胞激素的數據，對於那些取得不易的珍貴檢品來說，BD CBA是一大利器。分析軟體的使用，可立即計算出每個細胞激素的濃度，相當地方便，也可降低人為誤差的可能性。

圖二、BD CBA多重訊號定量分析技術原理簡圖

   

(1)檢品與微球作用(2)加入detector螢光標示抗體(3) 洗去未作用的抗體(4) 上機以CellQuest收取數據並以CBA軟體計算細胞濃度

 

ELISPOT採用與夾心ELISA方法極類似的原理。周邊血PBMC細胞經適當分離純化後，會被分配到單抗披被在貼有PVDF的微孔盤上，受到適當的抗原刺激，並將微孔盤放置於37℃的二氧化碳溫箱中過夜培養一段時間。一般而言，受抗原刺激6小時後記憶型T細胞會開始分泌g-干擾素，此時局部(在緊靠分泌細胞的周圍)分泌出的細胞因子會被PVDF薄膜上特異單株抗體捕獲。大約20小時後，研究人員可將未結合的因子和細胞洗掉，再加入生物素標記的檢測抗體。最後，為了讓被夾心結合的g-干擾素呈色，可加入StreptAvidin-過氧化酶複合物與不溶性酵素受質AEC。假如酵素受質在有相應細胞因子g-干擾素的位置上有紫紅色的小點，則每個小點代表一個分泌細胞，小點可用自動的ELISPOT影像掃描儀計數，每孔中點數則反映受測樣品中抗原特定T細胞的頻率，平均大小則反映記憶型T細胞生產g-干擾素的產能。

  
 
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Research Reagents